tecnologías emergentes Fig. 2. Cuantificación de la señal de intensidad de fluorescencia. (Fuente: propia). tiene afinidad por los grupos fosfato presentes en los ácidos nucleicos) que permite la fijación del ADN. El tipo de ADN que puede fijarse en la superficie de vidrio es variable, puede ser de doble cadena o cadena sencilla, fragmentos cortos o productos de PCR, aunque los oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla con una longitud de 60 nucleótidos son los que dan los mejores resultados. La metodología de la hibridación de micromatrices consiste en la incubación del portaobjetos que contiene los oligonucleótidos sonda con un ADN problema previamente marcado con un fluoróforo, el cual emite fluorescencia al ser excitado con un láser permitiendo su visualización posterior. Los fragmentos de ADN que sean complementarios a los oligonucleótidos depositados sobre el portaobjetos hibridarán por complementariedad de bases, quedando inmovilizados en la superficie. De esta forma, y mediante la cuantificación de la señal de intensidad de fluorescencia en cada punto, se podrá identificar la naturaleza y el origen del ADN problema (figura 2). El uso de microarrays de ADN ofrece una serie de ventajas, sobre otras metodologías del ámbito de la biología molecular, que lo hacen particularmente interesante para la detección de agentes de guerra biológica. La primera de ellas es su gran capacidad de escalabilidad, es posible imprimir una gran cantidad de moléculas diferentes de ADN sobre un portaobjetos de vidrio (hasta 30.000 puntos de ADN sobre un único portaobjetos) gracias al uso de robots dispensadores (figura 3). Este alto índice de escalabilidad permite analizar simultáneamente tantas moléculas de ADN diferentes como puntos contenga la micromatriz. Además de su escalabilidad, el uso de microarrays de ADN permite realizar un análisis paralelizable de las muestras, ya que se pueden imprimir simultáneamente decenas de portaobjetos idénticos que pueden ser analizados posteriormente. Así mismo, es un sistema muy versátil, es posible diseñar y fabricar micromatrices «a la carta» ofreciendo una plataforma abierta a futuras actualizaciones y ampliaciones. Una última ventaja de este sistema son sus escasos requerimientos de almacenaje (temperatura ambiente en un ambiente seco) sin que se vea afectada su capacidad de detección durante períodos más o menos largos. El Área de Defensa Biológica del Departamento de Sistemas de Defensa NBQ y Materiales Energéticos de la Subdirección General de Sistemas Terrestres del Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial «Esteban Terradas» (INTA) en colaboración con la Unidad de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CNB), desarrolló una micromatriz, con un elevado nivel de sensibilidad y de especificidad en la detección, que contenía sondas específicas para la identificación de cinco especies bacterianas de interés en Defensa por su potencial uso como arma biológica 2,4: Francisella tularensis (agente causal de la tularemia), Yersinia pestis (agente causal de la peste), Bacillus anthracis (agente causal de ántrax o carbunco), Brucella spp (agente causal de la brucelosis o fiebre de Malta) y Burkhordelia, en particular Burkhordelia mallei que produce la llamada enfermedad del muermo o Burkholderia cepacia que es patógeno oportunista en enfermos de fibrosis quística 9. Posteriormente, y como continuación con esta colaboración, se amplió el diseño existente mediante la incorporación de sondas correspondientes a los genes de virulencia codificados en los plásmidos pXO1 y pXO2 (moléculas de ADN extracromosómico presentes en bacterias que se replican y transmiten independientes del ADN cromosómico) de Bacillus anthracis, así como, sondas específicas de cinco nuevos microorganismos, dos de ellos causantes de enfermedad en el hombre Vibrio cholerae (agente etiológico del cólera) y Clostridium botulinum (productora de la toxina botulínica, el agente causal del botulismo) y tres especies abundantes en suelos y hábitats naturales: Pseudomonas putida, Bacillus subtilis y Bacillus atrophaeus (estos dos últimos definidos como simulantes de agentes de guerra biológica para el desarrollo de técnicas de identificación y validación/verificación de prototipos) 8. En la actualidad, se está trabajando en el desarrollo una micromatriz de ADN para la identificación de agentes virales susceptibles de ser usados como armas biológicas. En el caso de virus, la detección prematura constituye una faceta fundamental para la prevención de sus posibles daños, puesto que son resistentes a los medicamentos más comunes y su tratamiento exige el uso de antivirales, presentan una elevada virulencia y toxicidad, y son fácilmente transmisibles. El diagnóstico clínico por infección viral se realiza en base a la sintomatología y al aislamiento de los virus a partir de fluidos vitales del individuo afectado y detección inmunológica. Además, en algunos casos se puede cultivar (y por lo tanto replicar) el virus in vitro, lo que facilitará su identificación. Sin embargo, no siempre es posible la obtención de cultivos virales in vitro, por lo que se hace necesaria la aplicación de una tecnología que permita identificar de forma sencilla el agente causal de la enfermedad. Las metodologías basadas en la amplificación de ácidos nucleicos a partir de cantidades muy bajas de los mismos no son muy apropiadas en el caso de agentes virales, dado la gran variación que presentan en lo referente a la naturaleza y estructura de sus genomas (ADN monocatenario o bicatenario, ARN monocatenarios (cadena positiva o negativa) o bicatenarios). La hibridación de micromatrices de ADN es particularmente adecuada para la identificación de agentes virales, ya que permite identificar la presencia de virus concretos en la muestra problema de entre una colección de candidatos que estarían representados en la micromatriz. En particular, el Área de Defensa Biológica en colaboración con el CNB está desarrollando una matriz para la identificación de virus patogénicos pertenecientes a las familias Arenaviridae, Bunyaviridae (Hantavirus y Flebovirus), Flaviviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae y Orthomyxoviridae. Tendencias futuras La tecnología de microarrays de ADN es sencilla, rápida, paralelizable, Boletín de Observación Tecnológica en Defensa n.º 54. Segundo trimestre 2017 13
BOLETIN OBSERVACION TECNOLOGICA 54
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