M.ªV. Ortega García, et al. mo en caballos3. Sin embargo, dada la gran plasticidad genómica de B. mallei y B. pseudomallei4,5, disponer de otras dianas moleculares para la detección de estas especies patógenas del género Burkholderia podría superar las posibles limitaciones en relación a la sensibilidad y especificidad de los ensayos moleculares que se produjeran tras la aparición de nuevas cepas. El desarrollo de métodos de identificación de B. mallei no solo rápidos, sensibles y específicos sino también posibles de hacer de forma rutinaria, concretamente los basados en plataformas moleculares como la PCR en tiempo real, resultaría beneficioso tanto para proporcionar un adecuado tratamiento al paciente infectado como para la vigilancia epidemiológica y la investigación forense, en el caso de una liberación intencionada. OBJETIVOS Comparar dos PCRs en tiempo real cuantitativas para la identificación de Burkholderiamallei, en términos de sensibilidad y especificidad analíticas: una basada en la amplificación de 86 Sanid. mil. 2017; 73 (2) ADN mediante sondas de hibridación, desarrollada en el laboratorio de Biología Molecular del INTA y otra, mediante el uso de sonda TaqMan, desarrollado por Tomaso et al., 20063 y método molecular recomendado por la OIE. MATERIAL Y MÉTODO Amplificación parcial de genes de Burkholderia mallei/B. pseudomallei y B. mallei (la secuencia de cebadores y sondas aparece en la Tabla 1): – PCR duplex: orf11 (lectura de fluorescencia en el canal 705 nm para B. pseudomallei) y orf13 (lectura de fluorescencia en el canal 610 nm para B. mallei y B. pseudomallei) del sistema de secreción de tipo III TTS1del género Burkholderia6,7, mediante qPCRcon sondas de hibridación. – PCR simple: fliP (lectura de fluorescencia en el canal 530 nm) que codifica para la flagelina P de B. mallei mediante qPCR con sonda TaqMan3. La amplificación se llevó a cabo en un equipo LightCycler 2.0 (Roche) y las condiciones fueron: Tabla 1. Cebadores y sondas utilizados para las qPCRs, en las sondas de hibridación una va marcada con fluoresceina en el extremo 3´ (donor) y la otra con un fluoróforoLightCycler (LC) Red o similar en el extremo 5´ (acceptor); esta sonda también va fosforilada en el extremo 3´. La sonda TaqMan va marcada con un fluoróforo emisor en el extremo 5´ y un quencher en el 3´. La transferencia de energía se basa en el fenómeno FRET (FluorescenceResonanceEnergy Transfer). Microorganismo Gen diana Tipo de oligo Secuencia 5´- 3´ Referencia Burkholderia mallei/ orf11 cebador-FW CGGTTACCCCGAACATCAC Este estudio Burkholderia pseudomallei cebador-RV GCTAGGGCTATATCAGAGGGAC sonda-FW CGATTATTTCGCTGTGCCCGCC-FL sonda-RV LC Red705 -TCATAAATGCGTTGTCATCCGGCGTCC-PH Burkholderia pseudomallei orf13 cebador-FW CCGGTTCCGTGCAAGAG Este estudio cebador-RV GACCGGATAGTAGCGGTGG sonda-FW GGCCGCGACAAGCTGCT-FL sonda-RV LC Red 610 -GTCTTTACATGGGCCCGGCAGCGA-PH Burkholderia mallei fliP cebador-FW CCC ATT GGC CCT ATC GAA G Tomaso et al., 2006 cebador-RV GCC CGA CGA GCA CCT GAT T sonda 6FAM-CAG GTC AAC GAG CTT CAC GCG GAT C-BHQ1 Tabla 2. Reactivos utilizados y concentración final para ambos métodos de amplificación, en un volumen final de 20 μl y añadiendo 1 μl de ADN molde. Reactivos Volumen Concentración Sondas de hibridación (este estudio) Agua gradoBiología Molecular 11,4 μl MgCl2 25 mM 1,6 μl 3 mM Cebador orf11/13-FW (20 μM) 0,5 μl 0,5 μM Cebador orf11/13-RV (20 μM) 0,5 μl 0,5 μM Sonda orf11/13-FW (10 μM) 0,5 μl 0,25 μM Sonda orf11/13-RV (10 μM) 0,5 μl 0,25 μM 10X FastStart Master HybProbe(Roche) 2 μl 1X Sonda TaqMan (Tomasoet al., 2006) Agua grado Biología Molecular 14,7 μl Cebador fliP-FW (10 μM) 0,2 μl 0,1 μM Cebador fliP-RV (10 μM) 0,2 μl 0,1 μM Sonda fliP (10 μM) 0,2 μl 0,1 μM 5X TaqMan Master (Roche) 4 μl 1X
REVISTA DE SANIDAD FAS ABRIL JUN 2017
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