PCR cuantitativa en tiempo real para la amplificación de ADN de Burkholderia mallei: comparación... Sanid. mil. 2017; 73 (2) 89 plifica de forma exclusiva en B. pseudomallei y B. mallei, y no se amplifica en el resto de especies del género Burkholderia7. Estas diferencias permitirían identificar de forma específica ambas especies de Burkholderia. Los resultados de la validación conseguidos por el método desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular del INTA fueron similares a aquellos obtenidos por el método recomendado por la OIE (LD de 70 fg/reacción3) y por otros autores (eficiencia del 98,7-99 %, repetibilidad de 0,072-0,080, especificidad analítica del 93-100%2; especificidad analítica del 99-100%11). Respecto al LD al 95% de probabilidad obtenido mediante elmétodo de identificación basado en sondas de hibridación (70 fg/reacción o de 11,2 egc/reacción), éste fue inferior al que consiguió- Bowerset al., 201012, con un valor de 100 copias por reacción, pero superior al que obtuvo Janseet al., 20132, de 4,5 fg/reacción. Estas diferencias en el LD podrían deberse a que el método utilizado para su cálculo puede variar de unos estudios a otros. En relación a la especificidad del método basado en sondas de hibridación, hubo tres muestras que amplificaron dando lugar a un resultado dudoso que redujo en un 10% la exclusividad del ensayo; sin embargo, tras el análisis de las curvas de fusión estas muestras no dieron lugar a ningún pico de fusión, por lo que no se pueden considerar positivas. B. pseudomallei es una bacteria patógena presente en el medio ambiente que causa una enfermedad llamada melioidosis, similar al muermo. Afecta a humanos y animales de regiones tropicales y subtropicales, especialmente el sur y sureste asiático y el norte de Australia. También pueden darse casos en regiones no endémicas introducidos por viajeros procedentes de zonas endémicas13. B. mallei y B. pseudomallei son microorganismos estrechamente relacionados y provocan una enfermedad grave, y potencialmente fatal, en humanos. El diagnóstico de estas enfermedades es difícil en regiones endémicas, pero resulta aún más complejo en aquellas no endémicas, donde no están incluidas dentro del diagnóstico diferencial y la melioidosis concretamente es confundida frecuentemente con la tuberculosis14. Por todo ello, el desarrollo de un método de identificación rápido y fiable que pudiera discernir entre estas dos especiesdel género Burkholderia,como el desarrollado por el laboratorio de Biología Molecular del INTA, resultaría de gran utilidad. La mayoría de los formatos de sondas específicos de secuencia de ADN, usan el principio FRET (FluorescenceResonanceEnergy Transfer), en el que se produce la transferencia de energía desde una molécula fluorescente (fluoresceína) a otra molécula adyacente también fluorescente (p. ej., LightCycler Red 640 o similar). Las sondas de hibridación usan dos oligonucleótidos diseñados para que hibriden de forma específica con el fragmento amplificado durante la PCR; solo cuando los dos oligonucleótidos se alinean en regiones adyacentes sobre la molécula diana, los fluoróforos donante y aceptor se encuentran lo suficientemente próximos para que se produzca el fenómeno FRET. La sonda TaqMan contiene unfluoróforo emisor y un quencher muy próximos el uno del otro; cuando la sonda está intacta, el quencher suprime la señal fluorescente del emisor también vía FRET; durante la PCR, la polimerasa rompe la sonda, separando el emisor y el quencher, permitiendo al emisor emitir fluorescencia. Al final de la amplificación, las sondas TaqMan son digeridas mientras que las de hibridación permanecen intactas y pueden usarse en un experimento de curvas de fusión. En el caso de este estudio, el experimento de curvas de fusión se empleó para verificar la especificidad del fragmento amplificado mediante la comprobación de su temperatura de fusión, lo que evitó tener que recurrir a una electroforesis en gel de agarosa que alargaría el tiempo análisis de la muestra y ésta podría contaminarse. El mayor tiempo de amplificación durante la fase de alineamiento con la sonda TaqMan (63 °C durante 1 minuto) del método de referencia, podría haber alargado el tiempo de análisis en comparación con el método desarrollado en el laboratorio de Biología Molecular del INTA basado en sondas de hidrólisis (60 °C durante 10 segundos seguido de 72 °C durante 12 segundos); sin embargo, la preparación de la mezcla de reacción de la PCR duplex, más compleja por llevar dos parejas de oligonucleótidos, y la introducción del experimento de curvas de fusión tras la amplificación, en el segundo método, compensó las diferencias en tiempo. Por todo ello, los dos métodos se podrían considerar rápidos, en comparación con otras técnicas no basa- Figura 2. Detección molecular del gen orf13 de B. mallei y B. pseudomallei. A. Curvas de amplificación, fluorescencia recogida por el canal de 610 nm. B. Curvas de fusión, fluorescencia recogida por el canal de 610 nm.
REVISTA DE SANIDAD FAS ABRIL JUN 2017
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