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Bassy Álvarez O., et. al. DISCUSIÓN El rango lineal del ensayo estuvo comprendido entre 1,3x106 y 1,3x101 egc por reacción, con una buena correlación entre el valor de Cq obtenido y la cantidad de ADN (R2 igual a 0,9993). El análisis de regresión lineal mostró además una eficiencia de la qPCR del 93,4%, cerca del factor de amplificación ideal de 2 por cada ciclo de PCR. Los experimentos de qPCR realizados indicaron que el límite de detección del ensayo (al 95% de probabilidad) es de aproximadamente 13 egc (95 fg) por reacción; esta sensibilidad analítica es mayor que la de otras qPCR específicas para detectar B. thuringiensis subsp. kurstaki, una con sonda Taqman desarrollada por Crighton et al.17 y otra con SyBr Green publicada por Douville et al18. Recientemente se ha publicado una nueva qPCR para identificar B. thuringiensis subsp. kurstaki, pero los autores no determinaron el límite de detección del método19. Por último, el cutoff value del ensayo aquí descrito se estableció en el ciclo 38. Todos estos resultados indican que el ensayo de qPCR presentado en este estudio permite una rápida detección, específica de secuencia, de B. thuringiensis con una elevada sensibilidad analítica. 88  Sanid. mil. 2018; 74 (2) La cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki empleada en este estudio fue correctamente identificada con los cebadores y la sonda de hidrólisis diseñados. Se observó además un producto de PCR del tamaño esperado y la ausencia de otros amplicones inespecíficos. Por otro lado, ninguna de las 24 cepas no diana utilizadas mostró un resultado positivo, lo que indica que tanto los oligonucleótidos como la sonda empleados no presentan reactividad cruzada con otros microorganismos, tanto genéticamente relacionados como no relacionados. Todas estas cepas fueron detectadas por amplificación de un fragmento del ADNr  23S para confirmar la presencia de ADN bacteriano. Para completar el proceso de validación será necesario utilizar muestras medioambientales reales contaminadas con B. thuringiensis, con el objeto de determinar la sensibilidad y especificidad diagnósticas del método, así como implementar un control interno de inhibición20. Desde el punto de vista de la biodefensa, es importante disponer de un ensayo molecular rápido, sensible y específico que permita la identificación de B. thuringiensis, simulador de B. anthracis. Este agente biológico es empleado muy a menudo en los ejercicios de entrenamiento de las Unidades Operativas de toma de muestras NBQ de las FAS, siendo necesaria su pos- Tabla 5. Resultados del estudio de especificidad. Especie Cepa Nº colección / Procedencia Resultado qPCR B. thuringiensis B. thuringiensis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. cereus B. cereus B. cereus B. cereus B. cereus B. cereus B. atrophaeus B. subtilis B. flexus B. mycoides B. circulans Y. pestis C. burnetti B. melitensis B. mallei R. rickettsii HD-1 HD-1 Hankow hide Sterne St Marys Paddintong VI Fildes 282 1501 Vollum NRRL B-569 desconocido 278/04/A3 435/06/A4 1235/06/A5 131/07/A6 NRS 1221A NRS 231 desconocido NRS 273 548/07/A11 NCTC 144 Nine mile ReV1 Biovar1 NCTC 10245-03 Smith CECT 4454 Bactur NCTC 2620 NCTC 8234 NCTC 5444 NCTC 109 NCTC 1328 NCTC 7752 NCTC 7753 NCTC 10340 ATCC 10876 ATCC 14579 aislado clínico aislado clínico aislado clínico aislado clínico CECT 38 ATCC 6633 CECT 62/02B CECT 4128T aislado clínico NCTC 144 desconocido desconocido NCTC 10245-03 desconocido positivo positivo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo


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