González-López, L., Peraile Muñoz, I., Rozas Sanz, G., Cabria Ramos, J. C. y Lorenzo Lozano, P. Familia Rhabdoviridae Las sondas seleccionadas para VEV reconocerán con muy alta afinidad diferentes estirpes del mismo virus y con menos afi-nidad otras especies de la familia. Familia Togaviridae La sonda 01 de VEE” (ssp.”North American”) tiene una alta probabilidad de hibridar de forma estable con muestras proce-dentes de los virus de la Encefalomielitis Equina del Este y del Oeste. Atendiendo a secuencias con un menor grado de iden-tidad (grupos 2 y 3), las sondas diseñadas podrían detectar un buen número de virus, entre ellos el virus de la Fiebre de Chikun-gunya, virus Mayaro, virus Sindbis y virus del río Ross. Familia Orthomyxoviridae Las sondas 01 y 02 seleccionadas para la estirpe H1N1 (A/ Puerto Rico/8/34) del virus de la Gripe A, formarían parte del primer grupo donde aproximadamente el 40-50% de las se-cuencias con mayor índice de identidad nucleotídica corres-ponden precisamente a los virus de la estirpe H1N1, con valor BLASTN10 mayor de 80 y que, por lo tanto, resultan práctica-mente idénticas a la sonda. Por su parte, las sondas 03 y 04 tie-nen un amplio rango de reconocimiento de diferentes estirpes del virus de la Gripe A, ya que aproximadamente el 17% de las secuencias de mayor índice de identidad corresponden al tipo H1N1. Un porcentaje similar de secuencias corresponde al tipo N5H1, además de observar porcentajes relativamente elevados de secuencias correspondientes al resto de tipos de virus de la Gripe A. Por último, las sondas 05 y 06 tienen un patrón de re-conocimiento particularmente específico de H1N1, ya que más del 75% de las secuencias corresponden a esta estirpe, mientras que el resto de estirpes virales están mucho menos representa-das. En este último caso cabe destacar, además, que el número de secuencias con un índice BLASTN10 superior a 80 (Grupo 1) es bastante inferior al observado para el resto de las sondas, lo que es también indicativo de su mayor especificidad por el tipo H1N1 del virus de la Gripe A. DISCUSIÓN Históricamente los métodos utilizados para la detección de virus precisaban del aislamiento y cultivo in vitro de los mismos a partir de una muestra tomada del paciente5 o del uso de técnicas inmunológicas15. Estos métodos diagnósticos consumen mucho tiempo y resultan muy costosos, además no todos los virus se pueden cultivar y los inmunoensayos dependen de la calidad y disponibilidad del antisuero y de la constante evolución de los serotipos virales. Las técnicas basadas en la amplificación de ácidos nucleicos son muy rápidas y sensibles6, pero tienen una capacidad limitada para multiplexación16,17. También son alta-mente específicas, esto es una ventaja para detectar un virus cuya secuencia es conocida, pero una gran desventaja para el descu-brimiento 156 Sanid. mil. 2018; 74 (3) de nuevas especies, o para detectar cepas variantes de una especie conocida. La utilización de micromatrices de ADN para la detección de virus se postula como una buena alternativa por lo que respecta al coste, tiempo de procesamiento, sensibilidad, especificidad y capacidad de detectar nuevos organismos y serotipos18,19,20. El éxito de la tecnología de hibridación de micromatrices depende de un correcto diseño de la colección de fragmentos diferentes de ADN (oligonucleótidos sonda) que se depositan sobre el soporte sólido. La utilización de secuencias altamente conservadas dentro de una misma familia, permite maximizar la probabilidad de que todos los miembros de la misma, incluidos los no secuenciados, no identificados o aquellos que hubieran evolucionado puedan ser detectados21. Además, debido al alto índice de variación nucleotídica que pueden presentar diferentes cepas/aislados es recomendable que las sondas diseñadas sean capaces de hibridar con el mayor número posible de estirpes per-tenecientes a la misma especie. Por tanto, las matrices se deben diseñar con una combinación de sondas de alta especificidad frente a regiones conservadas, de modo que puedan usarse en modo de detección y descubrimiento21. Teniendo en cuenta estas consideraciones, en este trabajo se han diseñado cuatro oligonucleótidos sonda (60 nt) con una alta especificidad para 12 virus pertenecientes a las familias en es-tudio (Arenaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae y Togaviridae) y seis sondas correspondientes al virus de la Gripe A tipo H1N1. El análisis de las sondas diseñadas para el virus de la Gripe A (fa-milia Orthomyxoviridae) muestran la posibilidad de detectar to-dos los tipos de virus pertenecientes a la misma especie. Además, tres sondas de tres especies de la familia Flaviviridae (DENV3, YFV y WNV) podrían detectar con una alta probabilidad la presencia de 16 especies de la misma familia y con una menor probabilidad, hasta 100 especies diferentes, lo que incrementa la capacidad diagnóstica de las sondas diseñadas. Este hecho es de especial relevancia si se tiene en cuenta que esta familia inclu-ye algunos de los géneros y especies más virulentos y que, por tanto, pueden ser susceptibles de ser empleados como agentes de guerra biológica. Las sondas diseñadas para el virus Hendra (familia Paramyxoviridae), a diferencia de la anterior, tienen una capacidad más limitada de hibridar de forma cruzada con otras especies, si bien se podrían detectar 16 especies diferentes, algu-nas de ellas representadas por más de una estirpe. El análisis de la capacidad teórica de hibridación cruzada de las sondas diseñadas en este trabajo, demuestra que todas ellas son capaces de detectar, con diferente grado de especi-ficidad, otros virus de la misma especie o diferentes especies dentro de una misma familia. Además, la hibridación cruzada entre sondas y secuencias similares, pero no idénticas, permi-tiría la detección de nuevas especies siempre que estuvieran estrechamente relacionadas con las que se utilizaron para el diseño de la sonda11. En base a los resultados obtenidos se puede predecir que este nuevo diseño bioinformático de sondas, puede ser muy eficaz como una posible herramienta diagnóstica en el estudio de patogénesis virales, descubrimiento de virus en enfermeda-des de etiología desconocida, así como en casos de bioterro-rismo22,23.
Revista-Sanidad-Militar-74-3
To see the actual publication please follow the link above