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Revista-Sanidad-Militar-74-3

Optimización del proceso de inmovilización de anticuerpos en inmunobiosensores Sanid. mil. 2018 74 (3)  161 Tabla 1. Porcentaje de retención del anticuerpo inmovilizado. Valores medios, erros estándar de la media (SEM), tamaño muestral (N). TRATAMIENTO MEDIA SEM N Absorción pasiva 67,46899 4,015005 13 Unión covalente glutaraldehido 66,8725 0,1666765 8 Unión proteína A/G 500 ng 70,63025 4,272686 12 Unión proteína A/G 1 ng 70,62134 2,086897 12 El test One-Way ANOVA y el post-test Tukey realizado no muestra ninguna diferencia significativa entre los grupos, indi-cando que el porcentaje de retención del anticuerpo es similar en todos los métodos de biofuncionalización ensayados (Figura 1, Tabla 1). Densidad del anticuerpo unido a la membrana El test de normalidad ensayado indica que la población pre-senta una distribución normal. El test One-Way ANOVA y el post-test Tukey realizado pone en evidencia que cuando se utiliza glutaraldehído se retiene más densidad de anticuerpo que mediante adsorción pasiva, mien-tras que cuando se utiliza proteína A/G se retiene una menor densidad de anticuerpo (Figura 2, Tabla 2). Tabla 2. Densidad del anticuerpo inmovilizado, porcentaje respec-to a adsorción pasiva. Valores medios, error estándar de la media (SEM), tamaño muestral (N). TRATAMIENTO MEDIA SEM N Absorción pasiva 99,99923 5,717187 13 Unión covalente glutaraldehido 130,0225 5,874725 8 Unión proteína A/G 500 ng 47,024 6,538109 5 Unión proteína A/G 1 ng 63,075 6,115917 6 Eficiencia del sistema de inmunocaptura del antígeno El test de normalidad ensayado indica que la población pre-senta una distribución normal. El test One-Way ANOVA y el post-test Tukey realizados muestran que existen diferencias significativas en la eficacia del sistema de inmunocaptura resultante en función del método de inmovilización del anticuerpo (Figura 3, Tabla 3). Así, la eficien-cia del sistema de inmunocaptura mediante unión covalente con glutaraldehído, es estadísticamente inferior a la de la adsorción pasiva, a pesar de mostrar un incremento en la densidad del Tabla 3. Efectividad de la unión a la BSA en los distintos modelos de biofuncionalización. Valores medios, erros estándar de la media (SEM), tamaño muestral (N). TRATAMIENTO MEDIA SEM N Absorción pasiva 29,9026 4,166912 5 Unión covalente glutaraldehido 7,86 0,362243 6 Unión proteína A/G 500 ng 67,889 0,536948 6 Unión proteína A/G 1 mg 69,79267 6,394182 6 anticuerpo fijado. La inmovilización del anticuerpo a través de proteínas mediadoras A/G incrementa la eficiencia de unión de la BSA en el sistema, siendo estadísticamente superior a todos los demás modelos de biofuncionalización ensayados, a pesar de mostrar una menor densidad de anticuerpo inmovilizado. DISCUSIÓN La inmovilización de los anticuerpos determina en gran me-dida la capacidad diagnóstica de los inmuno-biosensores por lo que es de crucial importancia el desarrollo de procesos de inmo-vilización que permitan una unión antígeno-anticuerpo lo más eficiente posible. Además, esta unión ha de ser también estable y duradera dado que su aplicación final es el desarrollo de biosen-sores para la detección de agentes de guerra biológica “on site”, por lo que tendrían que soportar duras condiciones ambientales y largos periodos de almacenamiento. Este trabajo, en consonancia con trabajos previos como aquellos publicados por Sharma y col, (2016)8 y Shen y col. (2017)9, señala la importancia de una buena inmovilización del anticuerpo. Hemos comparado las tres formas de inmovilización más frecuentes en superficies planares de amplio uso: la inmovi-lización por adsorción pasiva, la inmovilización covalente y la inmovilización orientada mediante proteínas mediadoras. La inmovilización del anticuerpo por adsorción pasiva es la comúnmente utilizada en los inmunoensayos de uso más exten-dido como los ELISAs. Por este motivo, se ensayó la biofuncio-nalización por adsorción pasiva y se comparó con un tipo de inmovilización que fuera más estable y duradera (inmovilización covalente) y con otro tipo de inmovilización que asegurara la orientación del anticuerpo y que fuera de elevada afinidad, aun-que no fuese completamente irreversible (biofuncionalización mediante proteínas mediadoras). La unión más fuerte que existe en la naturaleza es el enla-ce covalente, proporcionando uniones estables y duraderas. La inmovilización covalente del anticuerpo utilizando soportes activados con grupos aldehído, para inmovilizar las proteínas mediante una reacción con los grupos amino primario de su su-perficie11, está descrita en la literatura. El trabajo de Karey y Sir-basku12 muestra que el glutaraldehído sobre superficies de nylon, como las membranas Zprobe, incrementa la inmovilización de distintas proteínas en este tipo de membranas. Trabajos más re-cientes, como aquellos llevados a cabo por Peng y colaboradores (2016)13 demostraron que el glutaraldehído resultaba ser un mé-todo de fijación covalente de anticuerpos en discos de celulosa. Por esto se decidió estudiar el método de inmovilización covalente con glutaraldehído en nuestro modelo de inmuno-captura. Nuestros resultados muestran que el glutaraldehído, sí que incrementa la densidad del anticuerpo unido, pero no así el porcentaje de retención del mismo durante el proceso. Además, disminuye la eficacia de la unión antígeno-anticuerpo. Esto po-dría explicarse porque la reacción suele requerir pHs ligeramente ácidos y superficies hidrofóbicas. A pH superior a 6, como es nuestro caso, el glutaraldehído es altamente reactivo14 pudiendo provocar cambios que afecten al reconocimiento antigénico del anticuerpo. Por lo tanto, la inmovilización covalente con glu-taraldehído no ofrece ninguna ventaja sobre la inmovilización


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