Sanmartín Sánchez L., et al. Se conocen varios estudios de determinación de los niveles de cortisol en pelo de perros9-12. En unos se encontraron diferencias en los niveles de cortisol achacables a la vida en ambientes soli-tarios o la convivencia en perreras, así como a atributos como el color del pelo9; en otros se observó un paralelismo entre las re-acciones de comportamiento y los niveles de cortisol producidos por estímulos acústicos reiterados11. Los perros de trabajo de las FAS se encuentran sometidos a unas condiciones peculiares, donde el transporte, los distintos ambientes, personas y olores a los que se enfrentan, etc., pueden provocarles un aumento de estrés especialmente en situaciones de despliegue en Operaciones. A pesar de que la presencia de cortisol en el pelo reve-la el acúmulo de cortisol a largo plazo y puede ser un indicador del estrés crónico, también hay que tener en cuenta posibles variaciones estacionales. Por ello, se buscan herramientas para poder cuantifi-car el estrés objetivamente, y así intentar minimizarlo al máximo. El objetivo principal de este estudio es aportar una estima-ción de los niveles de cortisol del pelo de perros de trabajo de las Fuerzas Armadas en dos períodos estacionales (primavera y verano), como biomarcador del estrés crónico. Como objetivos secundarios se plantean: 1. Determinar si existen diferencias entre grupos de anima-les (intersujetos) sometidos a distintas condiciones am-bientales: despliegue en Afganistán y Territorio Nacional. 2 Investigar los posibles efectos de la estación del año y del despliegue en Operaciones sobre las concentraciones de cortisol en pelo de perros adultos de trabajo (intrasujetos). 3 Verificar si la determinación de los niveles de cortisol en pelo mediante la técnica ELISA tiene sensibilidad sufi-ciente para comparar con los niveles de referencia en esta especie y detectar diferencias entre casos y controles po-blacionales. METODOLOGÍA Población de estudio Se seleccionaron aleatoriamente un total de 24 perros de tra-bajo de distintas razas y edades, donde la proporción de sexos fue de 20 machos y 4 hembras. Los animales se dividieron en dos grupos (casos y controles) atendiendo a si desplegaban en Zona Operaciones (casos) en la estación de verano (Afganistán, casos: 8 individuos,) o por el contrario, se mantenían en Territorio Na-cional (controles: 16 individuos). El discreto tamaño de la población de estudio, se debió por una parte a que se desplegaron pocos animales, y también a mo-tivos de manejo para la obtención de las muestras. Los animales seleccionados no alteraron su actividad programada recibiendo el entrenamiento previsto previo al despliegue y su trabajo du-rante el mismo, así como también las condiciones ambientales para los individuos mantenidos en Territorio Nacional se man-tuvieron homogéneas (individuos sanos, actividad normal). Muestras Se rasuró una zona de pelo del abdomen de un área de 5 x 5 cm en cada individuo (casos y controles), obteniéndose dos 256 Sanid. mil. 2016; 72 (4) muestras pareadas, una en primavera (marzo) previa al des-pliegue y otra en verano (julio) durante el repliegue. Todas las muestras de los individuos casos y controles fueron obtenidas en condiciones similares (hora y día) y almacenadas a temperatura de refrigeración en bolsas individuales identificadas. El número total de muestras finalmente analizadas (41) fue inferior al número de muestras obtenidas (48), debido a que al-gunas no fueron aptas para su análisis. Las muestras aptas se clasificaron atendiendo a la estación del año (22 muestras de primavera y 19 muestras de verano) y al número de casos y con-troles (15 muestras obtenidas de los individuos casos y 26 de los controles). Asimismo, se subdividieron las muestras en 4 grupos: casos primavera (8), controles primavera (14), casos verano (7), y controles verano (12). Extracción y detección de cortisol en pelo Las muestras recogidas durante el año 2015 fueron remitidas al LIA (Laboratorio de Investigación Aplicada) donde a su re-cepción se almacenaron en congelación (-18°C) hasta el momen-to de su análisis. Se seleccionaron 250 mg de pelo por animal, que se introdujeron en tubos cónicos de 15 ml. Cada muestra se lavó usando 2,5 ml de Isopropanol (2-propanol 99,5% Sharlab) en agitación (1800 rpm durante 2,5 minutos) para eliminar la suciedad y los posibles esteroides externos sin afectar a los este-roides internos4. Las muestras se dejaron secar durante 36 horas a temperatura ambiente. A continuación, el pelo se cortó en frag-mentos <2 mm de longitud con una tijera, se pesaron entre 120- 150 mg por individuo y fueron introducidos en un microtubo de 2 ml. Se añadieron 1,5 ml de metanol por cada muestra, para a continuación incubarlos durante 18 horas a 30°C a la vez que se agitaban (100 r.p.m) (Mixer block®). El contenido de cada vial se centrifugó a 7000 g durante 2 minutos, se recuperaron 0,750 ml de la fase líquida y se incubaron en nuevos microtubos sobre una bandeja a 38ºC hasta la desecación completa y la obten-ción de un residuo13. Cada muestra se reconstituyó en 0,2 ml de PBS (phosphate-buffer saline) 0,05 M, pH= 7-7,5 y se agitó. Las muestras se analizaron mediante un kit de ensayo ELISA para la detección de cortisol en saliva (Demeditec®). La sensibilidad del kit de ensayo fue de 0,024 ng/ml, con un rango de detección de 0-30 ng/ml. A partir de la curva estándar se calculó la concentra-ción de la hormona (picogramos cortisol/ miligramo de pelo) en cada una de las muestras3. Análisis estadístico Todos los análisis estadísticos fueron realizados mediante el paquete estadístico SPSS 14.0 para Windows, y para la creación de figuras se empleó la aplicación Statgraphics plus professional 16.0.03. Se llevaron a cabo diferentes análisis en relación a los objetivos e hipótesis propuestos en este estudio. En primer lugar, se procedió a realizar un análisis descriptivo de diversas variables. Para ello se calcularon frecuencias, porcen-tajes, estadísticos de tendencia central y dispersión dependiendo de la naturaleza de cada una de las variables incluidas. A continuación, se llevaron a cabo diferentes pruebas esta-dísticas con un nivel de significación menor o igual a 0,05 para la comparación de las variables. Se contrastó la normalidad y
REVISTA DE SANIDAD FAS OCT DIC 2016
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