Optimización y Validación de una PCR en Tiempo Real para la Rápida Identificación de Bacillu… Sanid. mil. 2018; 74 (2) 85 ochenta años en el control biológico de plagas. Actualmente, los biopesticidas basados en B. thuringiensis se emplean en todo el mundo para el control de insectos de los órdenes Lepidóptera, Díptera y Coleóptera5. También se ha descrito en esta bacteria actividad tóxica frente a otros invertebrados como nemátodos, protozoos y platelmintos. La toxicidad frente a los insectos reside en las llamadas proteínas cristal (Cry), las cuales cristalizan formando unos cuerpos de inclusión intracelulares que son letales para las larvas6. Dichas proteínas son codificadas por diversos genes denominados cry. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR, desarrollada inicialmente por Kary Mullis en 19877, supuso un avance muy importante en el análisis de cepas de B. thuringiensis con el objeto de descubrir proteínas insecticidas inéditas. En el año 1991 apareció la primera PCR que permitía predecir rápidamente la actividad insecticida de nuevas cepas de esta especie8. También se ha utilizado esta técnica para identificar y detectar diferentes genes cry: en la actualidad se conocen más de 75 familias de genes cry distintas, localizados normalmente en plásmidos; dentro de la familia de genes cry1, los cuales codifican para proteínas específicas de lepidópteros, existen hasta 14 genes distintos9,10. Asimismo, se han implementado diferentes PCRs en tiempo real (qPCR) para identificar distintas cepas de B. thuringiensis. Por ejemplo, Guidi et al. desarrollaron en 2010 una qPCR que permite detectar B. thuringiensis subsp. israelensis mediante la amplificación de los genes cry4Aa y cry4Ba11. Por otro lado, en el año 2015 se optimizó la primera qPCR que amplifica una secuencia cromosómica específica de B. thuringiensis subsp. israelensis12. Bacillus thuringiensis es un simulador de Bacillus anthracis empleado muy a menudo en los ejercicios de entrenamiento de las Unidades Operativas de toma de muestras NBQ de las FAS. El objetivo del presente estudio es desarrollar y validar una PCR en tiempo real que permita la rápida identificación de esta bacteria, mediante la amplificación de un fragmento de 69 pb del gen cry1A. MATERIALES Y MÉTODOS Extracción y cuantificación del ADN molde El material genético de la cepa HD-1 de B. thuringiensis subsp. kurstaki empleado en este estudio fue obtenido en el Laboratorio de Biología Molecular del INTA, a partir de un liófilo adquirido a la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT 4454). Para obtener un cultivo enriquecido en esporas se empleó medio de esporulación13, comprobando el proceso periódicamente mediante la tinción de Schaeffer-Fulton14. Tras medir la densidad óptica del cultivo a 550 nm, se incubó el mismo a 70ºC durante 30 minutos para eliminar las células vegetativas. Finalmente, se purificó el ADN total de las esporas mediante el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) siguiendo las recomendaciones del fabricante y se almacenó a -20 ºC. La cuantificación del material genético de B. thuringiensis subsp. kurstaki se realizó en el espectrofotómetro ND-1000 (Thermo Fisher Scientific. Para determinar el número de equivalentes de genoma completo (egc), se calculó primero el número de moles que hay en una cantidad determinada de ADN (en gramos), diviendo esa cantidad por el peso molecular del genoma. Para calcular el peso molecular del genoma en Daltons (D), se multiplicó la longitud del mismo en pares de bases (6.600.000 pb en este caso) por el peso molecular de un par de bases (650 D). Luego, mediante el número de Avogadro (6,022x1023 moléculas por mol) se determinó el número de moléculas de ADN que hay en dicho número de moles, es decir, el nº de equivalentes de genoma completo. La fórmula simplificada para el cálculo de los egc es la siguiente: Número de egc = (cantidad * 6,022x1023) / (longitud * 1x109 * 650). Optimización de la PCR cualitativa en tiempo real Los cebadores y la sonda utilizados en este ensayo han sido diseñados en el laboratorio de bio-detección de DGA Maîtrise NRBC (Vert-le-Petit, Francia) mediante el software Primer Express 2.0 (Applied Biosystems) y la secuencia de referencia AY319967 (GenBank Accession Number). La sonda de hidrólisis lleva incluidos dos Locked Nucleic Acids (LNA), lo que permite reducir mucho su longitud sin que disminuya su temperatura de hibridación, aumentando así la especificidad del ensayo. La secuencia de todos ellos se indica en la Tabla 1. Tabla 1. Cebadores y sonda utilizados para amplificar el gen cry1A. Nombre Secuencia nucleotídica 5’>3’ Modificaciones BtF TGT AAT ACC GCC ACA GGA TAA TAG TG -- BtR GTA ACA TGA CCC AAT CGA TGG CTA A -- Bt LNA CCA CC+T CG+T GCG GGA 5’ FAM, 3’ BHQ1 + indica las posiciones de los LNA (+LNA). La amplificación se llevó a cabo en el equipo LightCycler 2.0 (Roche) empleando el kit LightCycler Taqman Master (Roche), con 5 μl de ADN molde en un volumen final de 20 μl. Los reactivos empleados y sus concentraciones se muestran en la Tabla 2. Para optimizar el ensayo se probaron tres temperaturas de hibridación distintas (58, 60 y 62 ºC). Las condiciones de amplificación finales fueron las siguientes: 1 ciclo de 95 ºC durante 10 minutos (activación de la polimerasa); 45 ciclos de 95 ºC durante 10 segundos (desnaturalización) y 60 ºC durante 1 minuto (hibridación y extensión). En todos los ensayos se utilizó ADN de B. thuringiensis subsp. kurstaki CECT 4454 como control positivo y agua libre de nucleasas como control negativo de contaminación (No Template Control, NTC). Todos los experimentos de qPCR fueron realizados siguiendo las recomendaciones de la guía MIQUE15. Tabla 2. Composición y volúmenes de la mezcla de reacción. Concentración Volumen por Concentración Reactivo inicial muestra final H20 grado PCR 9,4 μl Cebador BtF 10 μM 0,6 μl 0,3 μM Cebador BtR 10 μM 0,6 μl 0,3 μM Sonda Bt LNA 5 μM 0,4 μl 0,1 μM LC Taqman Master 5X 4 μl 1X
RSM 74-2
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