Protocolo para la identificación rápida y sensible de ricina en muestras ambientales ante una alerta... Sanid. mil. 2017; 73 (3) 155 Adición, como sustrato de la peroxidasa, de orto-fenilendia-mina (OPD) (0,5 μg/mL en tampón citrato-fosfato, añadiendo el peróxido de hidrógeno 30 % a la solución de OPD, en propor-ción 1/2000). Se incuba la placa de 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, hasta desarrollo de color. Adición de ácido sulfúrico 2N para detener la reacción. Lectura de la absorbancia a 490 nm (A490nm). En todas las etapas, el volumen añadido a los pocillos es 100 μL/pocillo, excepto en el caso del ácido sulfúrico, en el que se añaden 50 μL/pocillo. Entre las diferentes etapas del inmu-noensayo previas a la adición del sustrato, se realiza una fase de lavado, con tampón fosfato salino (PBS), para eliminar el excedente. Los anticuerpos utilizados son anticuerpos monoclonales in house. El uso de anticuerpos monoclonales garantiza la reprodu-cibilidad del ensayo. La manipulación de la muestra ha de hacerse en la cabina de citostáticos, al menos hasta la fase de adición del anticuerpo de detección. Optimización del ensayo Sensibilidad: Para mejorar la sensibilidad se modifican el marcado del anticuerpo de detección en el ELISA anterior-mente descrito: Se utiliza en un caso el marcado con biotina y en el otro caso el marcado con peroxidasa, y se realizan ambos ensayos en paralelo. Desarrollo de placas previamente preparadas y almacena-das: Para reducir el tiempo de respuesta del laboratorio tras la recepción de una muestra sospechosa de contener ricina, se uti-lizan placas previamente tapizadas y bloqueadas almacenadas a 4ºC que permitan iniciar el inmunoensayo en etapas avanzadas. Tratamiento estadístico de los resultados La cuantificación de ricina se calcula partiendo de los valores de absorbancia a una longitud de onda de 490 nm, obteni-dos en el ensayo de ELISA. Se representan los valores de absorbancia medida a 490 nm frente a su correspondiente concentra-ción de ricina conocida. Las curvas obteni-das se ajustan a una ecuación logística de cuatro parámetros (4 Parameter Logistic, 4PL) según la siguiente fórmula: y = A + (B - A)/(1 + (x / EC50)-D) Siendo y la A490nm, A la A490nm mínima, B la A490nm máxima, x la concentración, EC50 la concentración que produce un 50% de A490nm máxima y D la pendiente del pun-to de inflexión de la curva sigmoidal. Se define como límite de sensibilidad el valor más bajo de la curva que difiere esta-dísticamente del valor del blanco (median-te t-Student). Los valores de las muestras superiores al valor mínimo establecido se interpolan en la curva para obtener su valor teórico de concen-tración. El tratamiento estadístico se realiza con el software Gra-phPad Prism 5. Diagnóstico proteico El diagnóstico proteico se realizó mediante la técnica de SDS-PAGE8 (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Elec-trophoresis). Esta técnica permite determinar el tamaño y el número de cadenas polipeptídicas de cada una de las proteínas que pudiera contener la muestra. De este modo, un resultado positivo obtenido en el ELISA es confirmado a través de su es-tructura proteica, confirmándose así los resultados por dos téc-nicas diagnósticas, y eliminándose así también los falsos positi-vos que pudieran encontrarse. Para ello se realiza este ensayo en condiciones tanto reductoras como no reductoras. Las muestras son previamente tratadas y mezcladas con un tampón Laemmli, en una cabina de citostáticos. Para las condiciones reductoras se añade β-mercaptoetanol. Las muestras son hervidas a 90 °C durante 10 minutos y cargadas en geles de poliacrilamida 4-20 %, 24 μL/pocillo, de tal manera que esté incluido todo el rango de proteínas que pudiera haber en la muestra, desde las de menor peso molecular a las de mayor peso molecular. Se utilizan geles Criterion™ TGX™ (Tris-Glycine eXtended) precast de Biorad. Para la visualización de los geles, se utiliza un tinte fluorescente (Oriole™ Fluorescent Gel Stain de Bio-Rad), y tras 90 minutos de incubación a temperatura ambiente, en agitación orbital y en cabina de gases, se visualizan los geles en un transiluminador, obteniéndose así el perfil de las diferentes bandas proteicas que pudiera haber en la muestra. En este ensayo se utiliza como control positivo ricina y como control negativo proteína aglutinina, con la que la ricina com-parte gran similitud estructural, siendo inmunológicamente di- Figura 2. Visualización de las bandas proteicas de ricina (RCA60) y aglutinina (RCA120), en condiciones reductoras y no reductoras, y ejemplo de una muestra negativa para ricina.
REVISTA SANIDAD FAS JUL SEP 2017
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