I. Peraile Muñoz, et al. fícil de discriminar. La muestra se carga por duplicado tanto en condiciones reductoras como en condiciones no reductoras así como el estándar de peso molecular. RESULTADOS Ante una alerta/amenaza biológica, la Unidad de Gestión (UG) de la RELAB activa al laboratorio responsable, iniciándose así el protocolo de actuación. La muestra se analiza con máxima prioridad y los resultados obtenidos se comunican a la UG-RE-LAB que gestiona la información entre los órganos concernientes. Diagnóstico inmunológico La sensibilidad obtenida en el ensayo utilizando el marcado con biotina fue de 0,23 ng/mL mientras que el ensayo en el que el marcado utilizado fue directamente la enzima peroxidasa, mos-tró una sensibilidad de 0,49 ng/mL. (Figura 1) El ensayo que uti-liza el marcado con biotina, supone un incremento en el tiempo de ensayo de aproximadamente 1,5 horas respecto al ensayo que utiliza como marcado la peroxidasa (Tabla1). Tabla 1. Resumen de los resultados de los ensayos realizados en la optimización del ensayo ELISA para la determinación de ricina en muestras sospechosas. Tipo de Tiempo de ensayo Placas pre-tapizadas Marcaje 156 Sanid. mil. 2017; 73 (3) y pre-bloqueadas Sensibilidad (ng/mL) Biotina Tapizado (+/- 12 horas) + ensayo (7 horas) 5 horas 0,23 Peroxidasa (HRP) Tapizado (+/- 12 horas) + ensayo ( 5,5 horas) 3,5 horas 0,49 Diagnóstico proteico La utilización de los geles Criterion™ TGX™ precast, que logran una separación electroforética en 30 minutos así como el revelado con el tinte fluorescente tipo Oriole, permite obtener una caracterización electroforética de la muestra en 3 horas. Además, el uso de dicho tinte fluorescente permite visualizar una concentración proteica de hasta 1 ng/pocillo de proteína. La ricina presenta un peso molecular de unos 60 – 66 KDa. En el ensayo SDS-PAGE, la ricina muestra en condiciones no re-ductoras, una sola banda de unos 60 – 66 KDa, y en condiciones reductoras dos bandas de unos 30 KDa. La aglutinina, que tiene un peso molecular de unos 120 KDa, presenta en condiciones no reductoras una banda con un peso similar a 120 KDa y en condiciones reductoras tres bandas comprendidas entre los 40 y 30 KDa (Figura 2). DISCUSIÓN Las técnicas inmunológicas son las técnicas diagnósticas de elección, por su especificidad y sensibilidad y por la rapidez de diagnóstico respecto a otras técnicas que necesitan un procesa-miento previo de la muestra9,10. En este trabajo, el ensayo elegido es un ensayo inmunológico de tipo ELISA sándwich, en el que el anticuerpo de detección se encuentra biotinilado. Es un ensayo con una alta sensibilidad, similar o mejor a la de determinados ELISAs comerciales (1,5 ng/mL) y a ciertos ELISAs desarrollados in house11 (2 - 5 ng/mL). Además, esta sensibilidad se encuadra dentro del rango de sen-sibilidad obtenido en los distintos ELISAs in house optimizados para la detección de ricina en diferentes laboratorios europeos12. Sin embargo, la importancia de nuestros resultados consiste en haber conseguido un protocolo de actuación que combina un ensayo ELISA, con una buena sensibilidad y capaz de ofrecer resultados en un corto tiempo (3,5 horas), con un ensayo SDS-PAGE que complementa, confirma o matiza, los resultados del ELISA. Ante la naturaleza desconocida de las muestras, se estableció la realización en paralelo de una segunda curva patrón, cons-truida a partir de varios puntos de la curva patrón de ricina a los que se les añadió un porcentaje conocido de la muestra. Des-pués, se compara la A490nm obtenida en los puntos que presen-tan la misma concentración de ricina. Si la matriz de la muestra no interfiere en la unión con el anticuerpo, el valor de A490nm ha de ser el mismo en ambos casos. Sin embargo, si se obtiene una disminución estadísticamente significativa en la A490nm del punto de la curva patrón que tiene muestra, implica que la matriz de la muestra, que es desconocida, está interfiriendo en la unión antígeno-anticuerpo, con lo que una señal de A490nm negativa ob-tenida en los pocillos que contienen únicamente la muestra no necesariamente indicaría ausencia de muestra, es decir, podría tratarse de un falso negativo. Gracias a esta estrategia, es po-sible disminuir significativamente la probabilidad de obtención de falsos negativos, ligada a todo ensayo inmunológico y colo-rimétrico. En cuanto a la sensibilidad del ELISA, si bien es cierto que la utilización de anticuerpos policlonales frente al uso de anti-cuerpos monoclonales puede incrementar en cierta medida el grado de sensibilidad del ensayo al reconocer varios epítopos de la ricina10, este incremento se produce dentro del mismo rango de sensibilidad (ng - pg/mL), y el uso de anticuerpos monoclo-nales garantiza la reproducibilidad del ensayo al ser producido cada uno por su clon. Por otra parte, la sensibilidad podría in-crementarse en el futuro variando el sistema de detección utili-zado, bien variando el sustrato sobre el que la enzima unida a la biotina actúa, de tal manera que el producto no sea coloreado sino, por ejemplo, fluorescente10, o bien, modificando el sistema de detección mediante un sistema de detección óptico13 o de tipo plasmón superficial14. Por otra parte, tal y como ha sido previamente descrito, la ricina guarda una gran similitud con la aglutinina que es una proteína derivada de la misma semilla e inmunológicamente difícil de discriminar15. También existen otras proteínas codifi-cadas por el genoma de la semilla de Ricinus communis con la que la ricina guarda una alta homología y que han sido desig-nadas como ricina A, B, C, D y E16. La realización de un SDS-PAGE en paralelo permite visualizar las proteínas existentes en la muestra, lo que complementa los resultados encontrados en el ELISA. Así, una señal positiva será confirmada a través de
REVISTA SANIDAD FAS JUL SEP 2017
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