Peraile Muñoz I., Gil García M., Guamán Collaguazo CE., González López L., Cabria Ramos JC. y ... Unión orientada a través de proteína mediadora Se ensayaron dos cantidades de proteína quimérica A/G, 500 ng y 1 μg, en 10 μL de PBS, que se depositaron sobre la mem-brana y se incubaron a 4 °C toda la noche (o/n). La membrana, después de ser lavada y bloqueada con PBS-caseína, se incubó con el anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente y, tras un nuevo lavado para eliminar el excedente, se incubó con 50 ng de BSA-RPE, 1 hora a temperatura ambiente. Obtención de datos para cada método de inmovilización Se realizaron tres medidas de fluorescencia: Medida inicial del anticuerpo inmovilizado Después de la incubación del anticuerpo con la membrana y tras su correspondiente proceso de lavado, se midió la fluo-rescencia de FITC (ʎ excitación=490 nm; ʎ emisión= 521 nm; ʎcutoff=515 nm) mediante un lector de fluorescencia multipoci-llo (SpectraMaxGemini XPS, Molecular Devices). Medida final del anticuerpo inmovilizado (después de la inmunocaptura) Al finalizar el proceso de unión del anticuerpo con BSA-RPE y su posterior proceso de lavado, se midió la fluorescencia de FITC (ʎ excitación=490 nm; ʎ emisión= 521 nm; ʎcutoff=515 nm) mediante un lector de fluorescencia multipocillo (Spectra- MaxGemini XPS, Molecular Devices). 160 Sanid. mil. 2018; 74 (3) Medida de la BSA-RPE unida al anticuerpo inmovilizado (medida de inmunocaptura) Tras la incubación con BSA-RPE y posterior proceso de la-vado, se midió la fluorescencia de RPE (ʎ excitación=495 nm; ʎ emisión= 576 nm; ʎcutoff=570 nm) mediante un lector de fluorescencia multipocillo (SpectraMaxGemini XPS, Molecular Devices). Análisis de resultados Valoración de la inmovilización del anticuerpo – Lectura de la fluorescencia de FITC inicial y final del anticuer-po inmovilizado. – Cálculo de porcentaje de retención del anticuerpo: Compara-ción del valor final de fluorescencia de FITC asociada al anti-cuerpo anti-BSA respecto al valor inicial tras la incubación del anticuerpo y primer lavado. – Densidad del anticuerpo unido a la membrana. Se determinó el anticuerpo inmovilizado en términos de porcentaje, tomando como control el método clásico de adsorción pasiva. Análisis estadístico de los resultados: One Way ANOVA y posterior test de Comparación Múltiple Tukey. Valoración del sistema de inmunocaptura de BSA Lectura de la fluorescencia de RPE. Cálculo de la eficiencia del sistema de inmunocaptura: comparación del valor de fluorescencia de BSA obtenido respecto al valor de fluorescencia del anticuerpo inmovili-zado. Análisis estadístico de los resultados: El tamaño muestral fue de 12-6 (12 en el caso de la valora-ción del anticuerpo inmovilizado, 6 en la determinación de la eficacia del sistema de inmunocaptura). La normalidad fue previamente estudiada aplicando el test de normalidad D’Agostino-Pearson o el test de Kolmogorov- Smirnov (con el valor P Dallal Wikinson-Liliefor) (GraphPad Prism). Después se realizó un test One Way ANOVA y posterior test de Comparación Múltiple Tukey. RESULTADOS Valoración de la inmovilización del anticuerpo Porcentaje de retención del anticuerpo El test de normalidad ensayado indica que la población pre-senta una distribución normal. Figura 3. Efectividad de la unión a la BSA en los distintos modelos de biofuncionalización.* p< 0,05, ** p <0,01, *** p<0,001. Dife-rencias respecto al grupo “Absorción pasiva”. (One Way ANOVA seguido del test de Comparación Múltiple Tukey).
Revista-Sanidad-Militar-74-3
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