Validación y acreditación de procedimientos analíticos de macronutrientes: aplicación al análisis... Sanid. mil. 2015; 71 (4) 229 preparación física de la muestra33, que conlleva unas fuentes de in-certidumbre significativas (homogeneización/submuestreo, tritura-ción, etc.) y una causa de error importante en el análisis nutricional, incluso superior al muestreo34. Validación de procedimientos analíticosv En conservas de raciones de combate y platos cocinados, las posibles matrices pueden ser muy numerosas. Por tanto, se han se-leccionado MRC similares a las de las futuras muestras de rutina objeto del análisis35. En la validación de métodos analíticos cuantitativos, típicamen-te, se determina la precisión, exactitud/sesgo, linealidad, LD, LC, robustez y selectividad. Como los procedimientos de ensayo se apli-can al análisis de componentes mayoritarios, los estudios de los pa-rámetros de la calidad, se han centrado en el estudio de la precisión y el sesgo. La precisión intermedia o reproducibilidad intralaboratorio se halla a partir de la desviación estándar de los replicados. Otra posibilidad es estimar la varianza dentro de días y la varianza entre días, utilizando una tabla ANOVA; así, la varianza de la precisión intermedia, = S2 serie + S2 repetibilidad. En la estimación de la precisión también se han tenido en cuenta las recomendaciones del International Conference of Harmoniza-tion (ICH, 1996). Los valores que se obtienen son aceptables, aun-que en cenizas para un valor certificado del 0,22%, fuera del rango de determinación en las muestras reales, se alcanza una DERR del 16,62%, que se considera dentro de los límites del trabajo científico. El coeficiente de correlación al cuadrado o de regresión lineal (R2) es igual a 0,9942, y es un indicador de correlación, pero no de linealidad. No obstante, se considera un valor dentro de lo esperado, tratándose de muestras fortificadas. Efectivamente, el test F de Man-del, (PG=12,09; Fcrítico=2,818; P=0,05) indica que el rango de trabajo no es igual al rango lineal para una masa de grasa recuperada a una concentración baja y alta. En cambio, los resultados son lineales en ensayos con aceite de ricino, obteniéndose recuperaciones entre el 99% y el 100%. No se evidencian errores sistemáticos durante la ejecución de los procedimientos analíticos y todos los ensayos de aptitud resul-tan satisfactorios. Se debe de tener presente que la aplicación de tests estadísticos para comprobar que el procedimiento de ensayo es trazable, lleva consigo el riesgo de cometer un “error α” o un “error β”. Así, la probabilidad de cometer un “error β” depende de la incertidumbre de los MRC, precisión del método analítico, del valor tipificado verdadero, zv, y de otros factores. La ISO “Guide to the Expression of Uncertainty in Measure-ment” (1993) recomienda corregir los resultados por el sesgo signi-ficativo y no tener en cuenta este sesgo para incrementar la incerti-dumbre. A pesar de ello, parece razonable no corregir cada resultado individual por el sesgo, y en su lugar incluir el sesgo en la incerti-dumbre combinada. Se suele adoptar el criterio de corregir los resul-tados por el sesgo, cuando el error sistemático es estadísticamente significativo, y de abandonar el sesgo y no corregir los futuros re-sultados cuando el sesgo, δ, no es significativo al compararlo con la incertidumbre combinada, δ ≤k u(δ)36. En este sentido, existen diferentes expresiones37 que se utilizan de forma habitual para la incorporación del sesgo en la estimación de la incertidumbre expandida: U=U+δ ; U(RSSu)= k ; U(RSSU) ; SUMUU+=U-(-δ);U-=U+(- δ). La incertidumbre se estima conjuntamente considerando el pro-ceso analítico como una sola etapa y, previamente, se identifican las fuentes de incertidumbre. Por ejemplo, la etapa de hidrólisis en la determinación de grasa es una fuente de incertidumbre significativa. Debe tenerse en cuenta que en operaciones tales como hidrólisis, filtración, extracción, no se garantiza la conservación de la masa total de analito. Por otro lado, se entiende que ignorar el sesgo no significativo podría infraes-timar la incertidumbre38, especialmente cuando la incertidumbre del sesgo es grande y cuando el sesgo contribuye de forma significativa a la incertidumbre. Por consiguiente, se decide tener en cuenta el sesgo en el cálculo de la incertidumbre. También se recomienda la inclusión del sesgo no significativo en la incertidumbre expandida, cuando la incertidumbre del sesgo u(δ) es mayor que el 30% de la incertidumbre combinada39. Otro aspecto a considerar en la validación es el número de repli-cados, que deben ser suficientes para proporcionar una estimación fiable de la desviación estándar. La citada ISO 5725-3 recomienda realizar al menos 15 replicados, aunque el criterio más común es realizar 10 réplicas. En nuestro caso la muestra de referencia se ana-liza más de 10 veces, a los efectos de disminuir tanto el “error α” como el “error ß”, y de aumentar la potencia del test (1- ß). Mediante la expresión siguiente adaptada a un laboratorio indi-vidual, se puede determinar el número de veces que debe analizarse la muestra para detectar un sesgo mínimo40: λ ≥ (tα/2 +tß) . La única incógnita es n, ya que debe conocerse la precisión intermedia del método y la incertidumbre del valor de referencia, una vez fijado un sesgo mínimo y la probabili-dad α y ß. También son útiles otras expresiones que nos permiten determinar el límite de detección del sesgo, ΔDb, y el valor crítico, Δc: ΔDb= (t1- α/2 + t1- ß) σ/ +2U; Δc = (t1- α/2) σ/ +U, conociendo el número de replicados. El test para el sesgo se hace al nivel de significación α= 0,05, para detectar un diferencia absoluta, Δb, entre la media de un mensurando y el valor atribuido al mensu-rando (ß=riesgo de falso negativo), y 1- ß= 0,95, potencia del test). Por ejemplo, para proteínas obtenemos a un nivel de concentración bajo (ΔDb= 0,05%; Δc=0,02%); a un nivel de concentración medio (ΔDb= 0,17%; Δc=0,08%) y a un nivel de concentración alto (ΔDb= 0,62%; Δc=0,32%). No se han hallado resultados discrepantes mediante el test de Grubb´s α= 0,05, en ninguno de los procedimientos analíticos so-metidos a validación. Basándonos en el teorema del límite central, nos ha permitido aplicar inferencias de estadística paramétrica a los resultados obtenidos de medidas repetidas. Los ensayos de aptitud de macronutrientes constituyen una herra-mienta indispensable en la validación de los métodos analíticos41-43. El valor HORRAT, definido como la relación entre la desviación es-tándar de la reproducibilidad y la función de Horwitz (sR/H), muestra que los valores hallados se encuentran en el intervalo 0,5<HsR<2.044, lo que indica que los procedimientos de ensayo tienen una veraci-dad satisfactoria. Similares resultados se obtienen en el cálculo de HORRATr, en condiciones de reproductibilidad intralaboratorio. Es
Revista de Sanidad Militar de las FAS 71_4
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