Desarrollo de un método de detección de Ocratoxina A (OTA) mediante Cromatografía Líquida… Tabla 1. Contenido máximo de ocratoxina A en algunos alimentos (Reglamento (CE) 1881/2006). Alimento Contenido máximo de OTA (μg/kg) Cereales no elaborados 5 Uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas) 10 Café tostado en grano y café tostado molido (excluido el café soluble) 5 Café soluble (café instantáneo) 10 Figura 1. Estructura química de ocratoxina A (C20H18O6NCl), Pm 403,816. Sanid. mil. 2018; 74(4) 231 gulado por el Reglamento (CE) No 1881/20061 y depende del tipo de alimento (Tabla 1). La OTA produce en el hombre alteraciones carcinogénicas, nefrotóxicas, teratogénicas, inmunotóxicas y neurotóxicas. En los animales también provoca serios problemas de salud, espe-cialmente en el ganado porcino, afectando a la producción en dicho sector y de manera indirecta, al hombre2. Es tóxica por inhalación y por ingestión y presenta una elevada estabilidad, mostrando una gran resistencia a la acidez y a la temperatura. Su obtención es relativamente sencilla a partir de alimentos conta-minados, por lo que podría ser utilizada como un agente de gue-rra biológico o en un ataque bioterrorista, pudiendo representar un serio problema tanto de salud pública como de seguridad2,3,4. Por este motivo existe la necesidad de desarrollar y estandari-zar métodos de detección rápidos y específicos, que contribuyan a garantizar la seguridad de los ciudadanos, permitiendo la aten-ción médica y la aplicación de medidas de protección específicas en el menor tiempo posible. Algunos métodos desarrollados para la detección de esta micotoxina están basados en técnicas de cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia3,5. Estos son métodos rápidos, pero poco específicos6,7. En este sentido, la cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)) se revela como una técnica de diagnóstico muy adecuada para conseguir una detección rápida y específica de esta micotoxina, ofreciendo la posibilidad de crear bases de datos de toxinas relevantes para la salud pública y la seguridad. En un analizador de masas de tiempo de vuelo los iones ge-nerados en la fuente de ionización son retenidos mediante un potencial eléctrico y, seguidamente, son acelerados aplicando una diferencia de potencial eléctrico pulsado, adquiriendo una elevada energía cinética. De esta manera los iones recorren el tubo de vuelo, libre de campo, hacia el detector, con una veloci-dad constante inversamente relacionada con la raíz cuadrada de la relación de masa/carga de los iones, por tanto, el tiempo que tardan éstos en recorrer el tubo de vuelo y alcanzar el detector será proporcional a la relación masa/carga de los mismos. La resolución será mayor cuanto menor sea la dispersión de energía de los iones generados en la fuente. Esta dispersión se compen-sa mediante el uso de “reflectron” o “espejo iónico”, que reenfo-ca los iones de una misma relación masa/carga sobre el detector. Por estas características, este tipo de analizador ofrece una gran sensibilidad, resolución y especificidad, ya que todos los iones generados llegan al detector proporcionando información isotó-pica de los compuestos analizados8,9. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un método de detección de ocratoxina A, rápido y específico, utilizando la téc-nica de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de masas de tiempo de vuelo (HPLC-MSD (TOF)). MATERIAL Y MÉTODOS Para el desarrollo de este trabajo se utilizó una solución pa-trón de ocratoxina A (Figura 1) en metanol de las siguientes con-centraciones: 1 ppm, 2 ppm, 5 ppm y 10 ppm. Se utilizaron un equipo de HPLC 1200 y un MSD (TOF) 6210, ambos de Agilent Technologies, con una fuente de ionización electrospray (ESI). En todos los ensayos se trabajó en condiciones de fase rever-sa y en modo isocrático, utilizando una columna cromatográfica Zorbax SB-C18, 2,1 x 150 mm (5μm) a 40 ºC y se inyectó 10 μL de la solución patrón de ocratoxina A. Se llevaron a cabo 36 ensayos variando la composición y flujo de la fase móvil y las condiciones del detector de masas. En la siguiente tabla se muestra las fases móviles utilizadas con sus respectivas proporciones (Tabla 2). Tabla 2. Fases móviles y proporción de las mismas utilizadas en los ensayos. Fase móvil Proporción (v/v) Ácido acético 0,99 % / Acetonitrilo (ACN) 60:40 Ácido acético 1% / ACN 50:50 Ácido fórmico (0,1%) / ACN 50:50 Ácido Fórmico (0,1%) / ACN 70:30 Ácido fórmico (0,4%) / ACN 50:50 Ácido fórmico (0,8%) / ACN 50:50 Ácido fórmico (0,8%) / ACN 55:45 Ácido fórmico (0,4%) / Ácido fórmico (0,1%) en ACN 50:50 Ácido trifluoroacético (TFA) 0,01% / ACN 50:50 TFA 0,01% / ACN 55:45 TFA 0,01% / ACN 60:40 TFA 0,1% / ACN 50:50 TFA 0,01% / Metanol 55:45 TFA 0,01% / Metanol 50:50
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