Análisis de curvas de fusión de alta resolución para la tipificación de la mutación de la abiotrofia ...
Sanid. mil. 2020; 76 (1) 9
INTRODUCCIÓN
La abiotrofia cerebelar es una enfermedad neurodegenerativa
autosómica y recesiva. Cursa con signos neurológicos como temblores
de cabeza y ataxia, siendo la enfermedad del cerebelo más
frecuentemente descrita en caballos, fundamentalmente en el Pura
Raza Árabe1. Los potros afectados muestran signos clínicos desde
el momento del nacimiento y hasta los seis meses de edad. La enfermedad
es incurable, y también se ha descrito en otras especies,
como cánidos, óvidos, bóvidos e incluso humanos2,3.
La abiotrofia cerebelar está causada por una mutación puntual
localizada en el gen TOE1 del cromosoma 2 (ECA2) del caballo,
donde una guanina (G) es sustituida por una adenina (A).
Ello induce un cambio de una arginina por una histidina durante
la traducción proteica4. Esta modificación del gen TOE1 afecta
a la expresión del gen MUTYH, que codifica para una enzima
ADN glicosilasa, el cual, en condiciones normales, actúa reparando
las lesiones oxidativas del ADN nuclear y mitocondrial
que se producen en el desarrollo de las células de Purkinje del
cerebelo. La presencia de la mutación produce un degeneración
postnatal de las células de Purkinje, tanto a nivel de su regulación,
como de la expresión génica y localización5,6,7. Brault y
Penedo1 propusieron una técnica para la tipificación de la mutación
combinando una amplificación alelo-específica de la secuencia
con un análisis de fragmentos realizado con un secuenciador
automático de ADN.
El análisis de las curvas de fusión es un método simple para
detectar variaciones de la secuencia de ADN8–11. Conceptualmente,
se basa en los cambios que se producen en la disociación
del ADN de doble cadena al romperse los puentes de hidrógeno
cuando la molécula es sometida a altas temperaturas. La temperatura
de fusión de las moléculas de ADN de doble cadena
está influenciada por varios factores, como la longitud, el contenido
de GC y su composición, lo que permite distinguir entre
moléculas con diferentes secuencias12. El procedimiento consiste
en someter a las muestras a una amplificación de la secuencia
diana mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(qPCR)13. Tras ella, se eleva la temperatura hasta alcanzar
alrededor de los 95ºC. Durante esta fase, la fusión es controlada
mediante fluorocromos intercalantes14, los cuales emiten luz
cuando están unidos al ADN de doble cadena, pero que se apagan
al separase las hebras. Cuando el termociclador está capacitado
para medir a intervalos de temperatura de menos de 0,1ºC
de forma homogénea, se puede realizar lo que se denomina un
análisis de fusión de alta resolución (HRM, del inglés, High Resolution
Melting), la cual permite detectar variaciones entre secuencias
de una sola base15–18.
El Servicio de Cría Caballar de las Fuerzas Armadas cuenta
con seis Centros Militares de Cría Caballar, que a su vez disponen
de una importante cabaña equina de Pura Raza Árabe.
Algunas de las funciones de estos Centros consiste en la cesión
de caballos a los diferentes Cuerpos y Fuerzas de Seguridad del
Estado y a la Guardia Real, aunque también se encuentra el
fomento de las razas, remitiendo dosis seminales para la inseminación
de yeguas pertenecientes a entes públicos o privados.
Por razones sanitarias, económicas y comerciales, es de la mayor
importancia evitar la transmisión de cualquier tipo de enfermedad,
infecciosa o genética, a través de esta promoción de material
genético. En este sentido, la difusión de ciertas enfermedades
genéticas puede resultar difícil de controlar, dado que en muchos
casos es compleja su caracterización diagnóstica por la influencia
de factores ambientales que actúan sobre su expresión. Es
por ello que es necesario poner a punto técnicas sencillas y económicas
que permitan la detección de animales portadores de
mutaciones genéticas.
El objetivo de este trabajo es la puesta a punto de la técnica
de HRM para identificar individuos portadores de la mutación
causante de la abiotrofia cerebelosa.
MATERIAL Y MÉTODOS
Muestreo
La muestra control empleada corresponde a un individuo diagnosticado
clínicamente y tras un examen anatomopatológico como
enfermo de abiotrofia cerebelosa. Se seleccionan 93 caballos dentro
de los ancestros y colaterales de dicho animal enfermo hasta
la tercera generación. La selección se realiza dentro del banco de
muestras históricas almacenadas de caballos Pura Raza Árabe pertenecientes
al Servicio de Cría Caballar de las Fuerzas Armadas.
Extracción de ADN
La extracción se lleva a cabo siguiendo un protocolo estándar:
se diluyen 5 μl de sangre congelada con 500 μl de TE (Tris-HCl 10
mM, EDTA 1 mM pH=8), se centrifuga eliminando el sobrenadante,
se añaden de nuevo 500 μL de TE y se vuelve a centrifugar y
a eliminar el sobrenadante. Se añaden 100 μL de tampón K (Tris-
HCl 10 mM, pH 8,5; MgCl2 2,5 mM; KCl 50mM; Tween 20 0,5%)
y 0,5 μl de proteinasa K (20 mg/ml). Se incuba a 56ºC durante 45
min y posteriormente a 95ºC durante 10 min.
Amplificación y análisis de fragmentos
Se tipifica la muestra control junto con otras 46 muestras
de caballos Árabes con la técnica de Brault y Penedo1 usando
el secuenciador ABI Prism 377 (Applied Biosystems, USA). El
análisis de fragmentos y la tipificación de los genotipos se realizan
con los programas Genescan v3.2 y Genotyper v2.1 (Applied
Biosystems, USA).
Selección de cebadores
Se diseñan cebadores con el programa Primer 3 Plus19, tomando
como referencia una secuencia de ADN de contiene la
mutación (ECA2:13074277G>A)4 registrada en la base de datos
EquCab3.020. Los cebadores fueron diseñados para producir amplicones
menores de 90 pares de bases (pb) con una temperatura
de hibridación de alrededor de 60ºC y un porcentaje en el contenido
de CG de entre el 30% y el 80%. Se obtuvieron cuatro configuraciones
de 66, 71, 88 y 89 pares de bases. La especificidad de
la secuencia de los cebadores se confirmó por análisis BLAST21.