Jiménez Heredia, I., et. al.
Todos los cebadores se sintetizaron en un proveedor habitual y
fueron purificados con HPLC (Tabla 1).
Análisis de curvas de fusión de alta resolución (HRM)
El análisis de curvas de fusión requiere una primera etapa de
amplificación de una secuencia determinada mediante una reacción
en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR). La concentración
final de los reactivos es 0,6 μM de cebadores y 2% de
EvaGreen® (Biotium, Hayward, CA); 1 unidad de polimerasa
(MyTaq™ DNA Polymerase). El resto de reactivos van incluidos
en los 4 μl de tampón proporcionado por el fabricante. Se utilizan
4 μl de muestra de ADN y se añade agua hasta completar
el volumen total de reacción de 20 μl. Para la amplificación se
emplea el termociclador LighCycler 480 II (Roche, USA). Las
diferentes etapas de la amplificación consisten en una fase de
desnaturalización y activación de la polimerasa de 5 min a 95°C,
seguido por 35 ciclos de 15 s a 95°C, 20 s a 60ºC y 20 s a 72°C.
La adquisición de la fluorescencia se hace en la etapa de síntesis
(72ºC). A continuación, se lleva a cabo un incremento de la temperatura
en etapas de 0,1ºC desde 60ºC a 95ºC durante el cual se
registra la fluorescencia para detectar la temperatura en que las
secuencias amplificadas se disocian en cadenas simples.
El análisis HRM se lleva a cabo mediante el módulo Gene
Scanning v1.2 que ofrece el software de análisis del termociclador;
inicialmente se ajustan todas las muestras a una fluorescencia
relativa y posteriormente se normalizan las curvas respecto
a la muestra control. Se identifican los diferentes genotipos de
cada secuencia según la forma de las curvas.
En todos los experimentos se tipifican las muestras del caballo
afectado de abiotrofia cerebelosa (control, genotipo A/A), un
portador de la mutación (G/A) y un sano no portador (G/G),
determinados previamente según la técnica de análisis de fragmentos
en electroforesis de Brault y Penedo1.
Se valida la técnica mediante tres pruebas: a) sometiendo los
fragmentos amplificados a una electroforesis sumergida en gel de
agarosa al 3% con un marcador molecular de ADN (CentiMark
PCR Marker, Vivantis) con el fin de comprobar que tengan el
tamaño deseado y descartar la presencia de dímeros y otros
fragmentos que podrían interferir con las curvas de fusión; b)
comparando los resultados con los obtenidos con la técnica de
análisis de fragmentos4; y c) haciendo un seguimiento genealógico
de las muestras de los individuos enfermos y portadores con
el programa Pedigraph®22.
RESULTADOS
En todos los casos las muestras se amplifican mediante la
qPCR y se generan curvas de fusión identificables por el programa
del termociclador.
Con los cebadores de la secuencia ABIO66 se obtienen diferencias
de 0,7ºC entre los homocigotos A/A y G/G en las temperaturas
de disociación. Sin embargo, la reacción de control
de amplificación sin muestra genera un fragmento de tamaño
similar, derivado posiblemente a la formación de dímeros entre
los cebadores.
La secuencia amplificada ABIO77 presenta un problema similar,
donde las estructuras formadas por dímeros en la reacción
sin muestra también son similares a los fragmentos amplificados.
La amplificación de la secuencia ABIO88 se descarta porque
genera demasiados fragmentos con temperaturas de fusión diferentes,
lo que dificulta la interpretación.
Finalmente, con los cebadores usados para amplificar la secuencia
ABIO89, se produce una banda de electroforesis muy
específica, sin dímeros, no observándose bandas apreciables en la
reacción sin muestra (figura 1). Además, en las curvas de fusión
se aprecia una separación de 0,5ºC entre los grupos de genotipos
A/A y G/G (figura 2A). El análisis HRM permite poner de
manifiesto estas pequeñas diferencias entre genotipos de forma
objetiva con una curva sinusoidal de los heterocigotos muy característica
(figura 2B).
En el análisis de las muestras, se han detectado seis casos de
enfermos (genotipo A/A) que no han tenido descendencia y 21
casos de portadores (genotipos A/G).
El análisis genealógico contempla tres generaciones de
ancestros de la muestra positiva que dio lugar al estudio, en
Tabla 1: Identificación, tamaño, secuencias (D: directa, R: reversa) y temperaturas de fusión (Tm) de las parejas de oligonucleótidos
usados como cebadores.
Identificación Tamaño (pb) Secuencia cebadores 5’ 3’ *Tm (ºC)
ABIO66 66
10 Sanid. mil. 2020; 76 (1)
D-> GCCCAGGGAGAGGATAGAA 59
R-> TGCATCGAGGAACGTTACAA 56
ABIO71 71
D->GGCCCAGGGAGAGGATAGAA 63
R->AAGGTGCATCGAGGAACGTT 58
ABIO88 88
D->ATACCTTGTCTGGCTGCTGC 60
R->CGTTACAAGGCCGTGTGTCA 60
ABIO89 89
D->GTCTGGCTGCTGCTTAAAGC 60
R->TCGAGGAACGTTACAAGGCC 60
*Tm= 100,5+(41(G+C)/(A+T+G+C))-(820/(A+T+G+C))+16,6log10(Na+)